### 培养条件

培养条件气相：95%空气 + 5%二氧化碳；温度：37℃，培养基中加入10% FBS和1% P/S。该细胞系来源于DJGriad，通过肺癌组织移植建立，患者为一名58岁的白人男性。A549细胞能够通过胞苷二磷酸胆碱途径合成高含量的不饱和脂肪酸卵磷脂。

### 传代方法

首次传代建议比例为1:2。对于传代情况，通常每2天更换一次培养液。另外，建议在同一时间购买优质吃料，确保细胞状态良好。收到细胞后，应将其处理至最佳状态，并灌满完全培养液后封好瓶口，以保证运输过程中的细胞存活率。

在收到细胞后，首先用75%的酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放置于超净台内进行严格的无菌操作。接着，将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便让细胞稳定后再进行后续处理。使用显微镜观察细胞的生长情况，并记录不同倍数的照片（最好为40x、100x、200x各一张），前三天的照片将作为重要的售后依据。未提供照片默认状态良好。

### 细胞培养步骤

a. 细胞传代：若细胞汇合度未超80%，则收集瓶中的完全培养液至离心管中，留5ml培养基，并放入37℃、5% CO2的孵箱中培养；若细胞密度超80%，则可进行传代培养。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS轻轻洗涤细胞1-2次。

2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态；若细胞大部分变圆并脱落，迅速返回操作台，轻轻敲打培养瓶后添加5ml以上的完全培养基停止消化。

3. 轻轻吹打细胞，确保其完全脱落后吸出，然后将细胞悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。

4. 按1:2的比例进行分瓶传代（即两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

b. 悬浮细胞传代步骤：

1. 半换液法：竖直放置培养瓶，静置1小时，轻轻吸出约3ml培养基后补充3ml的完全培养基。若培养基变色慢，可直接添加约500ul FBS；于传代时，可直接补给5ml的培养基，分至两个培养瓶中。一般这种方法可以传代3次左右，再进行一次离心去除死细胞。

2. 离心换液法：如需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液重悬，并将细胞悬液按1:2的比例分至新T25瓶中，添加6-8ml新配置的完全培养基，以维持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存和复苏

c. 细胞冻存：1. 细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞；2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，通过轻吹使细胞脱落，再将悬液转移至离心管中，1000RPM离心5分钟；3. 待弃去上清后，将沉淀细胞加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001）混匀后装入冻存管中；4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如需后期转入液氮罐，应在-80℃冰箱中存放24小时以上。

d. 细胞复苏：1. 从液氮中取出冻存管（务必佩戴防护面具），迅速放入37℃水浴中解冻，直到无结晶后，擦拭冻存管外壁；2. 将冻存管中的细胞转移至含有5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养；4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

在运输过程中，有些细胞可能脱落，这是正常现象。如果脱落数量较多，可以将培养瓶所有培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，并收集上清用于过渡培养（后期进行对比培养）。沉淀细胞后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后重悬，并消化1-2分钟后再加5ml完全培养基终止反应。再次离心、弃去上清后，补加1-2ml完全培养基重悬，然后按1:2比例分瓶传代（即两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。请保持细胞培养环境的严格无菌，确保细胞的生长和代谢活性，这也是尊龙凯时人生就博品牌致力于提供优质生物医药服务的一部分。